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Laboratorio de biología molecular

Laboratorio de Biología Molecular

Origen

En Julio del 2010, se estableció el Laboratorio de Biología Molecular (LBM) del Centro Nacional de Referencia de Control Biológico (CNRCB). Su función inicial fue la detección por métodos moleculares de los agentes causales del Huanglongbing de los cítricos (Candidatus liberibacter spp.), y como apoyo a la campaña del mismo nombre. Desde su creación hasta Diciembre 2013, el LBM logró más de 18 mil diagnósticos de HLB por PCR en tiempo real para 13 estados citrícolas del país.

Posteriormente, ante el establecimiento de las dos colecciones de referencia del CNRCB: la Colección de Hongos Entomopatógenos (CHE) y la Colección de Insectos entomófagos (CIE), a partir del 2012 el LBM se fortaleció con la creación de un nuevo edificio, por lo que la línea de trabajo dio un giro diferente al apoyar de manera sustancial en la identificación y caracterización molecular de los organismos benéficos depositados en ambas colecciones, siendo en la actualidad uno de los principales objetivos del laboratorio.

Objetivo

La misión del laboratorio es de atender de manera eficaz y oportuna las necesidades emergentes de identificación, tipificación y clasificación de organismos benéficos, así como contribuir con la investigación científica del sector agrícola en apoyo a los productores e instituciones para la solución de problemas de relevancia.

Identificación molecular de hongos entomopatógenos

El LBM apoya en la identificación molecular de los aislados depositados en la CHE; de esta manera no sólo la determinación específica se realiza por métodos tradicionales sino que se involucra la secuenciación de diferentes regiones de ADN (zonas intergénicas, genes estructurales, funcionales y ribosomales). Para la identificación de hongos entomopatógenos, el LBM estandarizó e implementó una estrategia multigénica (MLST, por sus siglas en inglés) que conlleva la concatenación de tres o más regiones de ADN elegidas en base a su poder de discriminación y resolución. El procedimiento incluye, la extracción de ADN de cada muestra(s), la selección y amplificación por PCR de los distintos marcadores moleculares, servicio de secuenciación y el análisis bioinformático (edición e interpretación filogenética bajo diferentes métodos de reconstrucción filogenética: ej. Neighbour Joining, Máxima Verosimilitud, Máxima Parsimonia e Inferencia Bayesiana). 

Figura 1. Estrategia experimental para la identificación molecular de hongos entomopatógenos.

Estrategia experimental para la identificación molecular de hongos entomopatógenos.

Actualmente, se realiza la identificación de las muestras (1) del género Metarhizium, de acuerdo a 7 regiones: el intrón del factor de elongación 1-α (TEF) de 800 pares de bases (pb), el exón del TEF de 1100 pb, la beta tubulina (ß-tub) de 1500 pb, la subunidad grande 1 de la RNA polimerasa II (RPB1 a y b) de 3000 pb y la subunidad grande 2 de la RNA polimerasa II (RPB2 a y b) de 2100 pb; su concatenación hace un total aproximado de 8500 pb; (2) del género Beauveria sobre 6 regiones: la zona intergénica Bloc de 1500 pb, el exón del TEF de 1000 pb, la RPB1 a y b de 2900 pb y la RPB2 a y b de 2100 pb; la concatenación de estas 6 regiones arrojan un total de 7500 pb; (3) del género Isaria en base a 3 regiones: ITS (ITS1-5.8S-ITS2) de 550-600 pb, ß-tub de 1500 y el exón del TEF de 1000 pb; el análisis se hace con las tres regiones de manera individual; (4) del género Hirsutella bajo el análisis de 6 marcadores: la región ITS de 600 pb, el exón del TEF de 1000 pb, la subunidad menor del ARN ribosomal (SSU o 18S) de 1100 pb, la subunidad mayor del ARN ribosomal (LSU o 28S) de 800 pb, el RPB1 de 700 pb y RPB2 de 1000 pb. Asimismo este año, se ha iniciado con la primera etapa en la identificación de los géneros de baja representación en la colección por ITS (ej. Acremonium, Lecanicillium, Aschersonia, Akanthomyces, Cordyceps, Entomophtora y Nomuraea); el desarrollo del estudio incluye la estandarización de los protocolos de extracción de ADN genómico, amplificación por PCR y el análisis bioinformático.

De esta manera, la sistemática molecular y los análisis filogenéticos realizados para cada una de las muestras, proporcionan una aproximación confiable y certera. La Dirección General de Sanidad Vegetal (DGSV-SENASICA) a través del CNRCB, promueve el uso de hongos entomopatógenos en programas oficiales para el combate de plagas agrícolas, por lo que es sumamente importante el establecimiento de una precisa identificación.

Cuadro 1. Aislados de la Colección de Hongos Entomopatógenos (CHE), identificados a nivel molecular que son utilizados en programas oficiales para el control biológico de plagas en México.

 

Aislados de la Colección de Hongos Entomopatógenos.

Identificación molecular de insectos entomófagos

La biodiversidad de insectos comprende la variedad de ecosistemas, especies y genes, por esta razón es una prioridad acelerar su descripción y conservación. El LBM contribuye estrechamente con la CIE en la determinación molecular de los organismos con el fin de complementar y enriquecer la identificación taxonómica realizada por la colección. Actualmente, el LBM realiza protocolos destructivos y no destructivos del tejido de ejemplares de insectos para la obtención de ADN, así como estrategias que permiten la identificación al nivel género o especie, por medio del código de barras de la vida, principalmente en el empleo del gen mitocondrial Citocromo Oxidasa I (COI). 

Los resultados en esta línea de investigación, se encuentran reflejados en el establecimiento y adecuación de protocolos específicos para obtener buena calidad del ADN de cada espécimen, así como protocolos que permitan obtener ADN de ejemplares únicos, con gran valor científico o de más de 20 años de colecta y aun así, conservar las características morfológicas en buenas condiciones. Adicionalmente, se ha logrado la estandarización de protocolos de PCR para las regiones COI con diversos primers y la estandarización de la región 28S de la subunidad mayor del ARN ribosomal. Hasta la fecha, se han identificado miembros de la familia Forficulidae (Doru spiculifarum), Chrysopidae (Ceraeochrysa cincta y Chrysoperla externa), Coccinellidae (Coleomegilla maculata, Cycloneda sanguinea, Hippodamia convergens...), Hymenoptera (Polistes exclamans, Tamarixia radiata…) y algunos miembros del orden Hemiptera, como son Orius insidiosus y Diaphorina citri.

Figura 2. Estrategia experimental para la identificación molecular de insectos entomófagos.

Estrategia experimental para la identificación molecular de insectos entomófagos.

El LBM, pretende consolidar una “metodología de identificación molecular” o “taxonomía por ADN” a partir de poco material de especies de diferentes insectos y en el futuro, lograr la determinación de especies crípticas o con ciclo de vida parcialmente/totalmente desconocido para contribuir con información nucleotídica a la base de datos electrónica que está siendo desarrollada por la CIE.

Otras actividades

El laboratorio colabora de igual manera, en las distintas áreas del CNRCB en varios proyectos de investigación:

  1. Evaluación de la estabilidad genética de hongos entomopatógenos antes y después de ser sometidos a diferentes métodos de conservación. La determinación se hace con la técnica de polimorfismos en la longitud de fragmentos amplificados (AFLP, por sus siglas en inglés); la finalidad de este proyecto es apoyar a la CHE en la selección de los mejores métodos de conservación.

  2. Desarrollo de los marcadores moleculares como: microsatélites o ínter-microsatélites (SSR o ISSR, por sus siglas en inglés) para la caracterización de la diversidad genética de las poblaciones de hongos entomopatógenos.

  3. Desarrollo de la técnica de detección de haplotipos en insectos entomófagos con la secuenciación del gen COI; apoyo para el control de calidad en la reproducción masiva de insectos entomófagos (ej. Tamarixia radiata y Ceraeochrysa valida).

Formación de recursos humanos. El laboratorio recibe estudiantes de licenciatura y maestría, así como de ingeniería para la realización de estancias profesionales y desarrollo de tésis.

Visitas científicas y guiadas. Se realizan visitas a través de las instalaciones del LBM con el propósito de que el público en general, estudiantes e investigadores conozcan las instalaciones y el trabajo que se realiza en el laboratorio.

Difusión. El LBM elabora documentos de divulgación y material científico para presentar los avances de los distintos proyectos que desarrolla en la comunidad científica experta en materia de control biológico.

Perspectivas

El esquema de trabajo y el uso de las nuevas herramientas y estrategias moleculares, proyectan que el LBM del CNRCB se coloque como referencia para la identificación y caracterización molecular de los organismos benéficos como apoyo al sector agrícola de México.

Laboratorio de Biología Molecular

Preparación para un corrida con el equipo: Fragment Analyzer.

Instalaciones Laboratorio de Biología Molecular

Última modificación: 13 de Octubre de 2015 16:09:49
Por: Sanidad Vegetal